滴眼給藥毒性試驗的（de）目的

滴眼給藥毒性試驗是重（chóng）複給藥一（yī）般毒性試驗，主要用（yòng）於（yú）研（yán）發滴眼藥物。歐盟發布的（de）《醫療用品非臨床局部耐受性試驗指導原則》（CPMP/SWP, 2001）明確規定了單次給藥和重複給藥眼部（bù）耐受性試驗的相關事宜。美國食（shí）品藥品監督管理局發布的（de）《藥品以及可替代性給藥藥（yào）品非臨床安全性（xìng）評價指導原則草案（àn）》（FDA/CDER, 2008）則明確要求在滴眼給藥時（shí）應開展（zhǎn）係統藥代動力學（PK）和眼科檢查（包括裂隙燈顯微鏡檢（jiǎn）查（chá）、眼底檢查、眼壓測量及組織病理（lǐ）學（xué）檢查）。然（rán）而，這兩份（fèn）指導原則中的相關規定均較簡要，缺乏滴眼給藥毒性試驗詳細設計的具（jù）體內（nèi）容。目前，尚（shàng）無滴眼給藥毒性試驗的確切定義（yì）。日本（衛生福利部，1999）依據ICH M3指導原則（zé）（ICH, 2009）和ICH S4指導原則開展滴眼給藥毒性試驗（yàn）。這（zhè）些原（yuán）則通（tōng）常適（shì）用於係統給藥的藥物。

有人（rén）常常將滴眼給藥毒性試驗與眼刺激試驗混為（wéi）一談（tán）。實際上（shàng），滴眼毒性預試驗、一周或兩周的重複給藥滴眼毒性試驗（yàn）的（de）方案與眼（yǎn）刺激試驗的方案（àn）有相似之處（OECD, 2012）。

目前，眼（yǎn）刺激試驗通常使用兔子進行，以評估化學物質（zhì）在粘膜給藥（yào）或（huò）人體偶然接觸時的安全性（OECD, 2012）。眼（yǎn）刺激試驗的主要目的是檢測眼表的刺激或腐蝕反應。

相比之下，滴眼給藥毒性試（shì）驗的主要目的是評估眼科藥物的（de）一般毒性。因此，滴眼給藥毒性試驗的檢（jiǎn）查項目包括組織病理學檢查、眼部附屬器以（yǐ）及全身髒器的評價。這兩（liǎng）種試驗的差異見表（biǎo）1。

表1 滴眼給藥毒性試（shì）驗和（hé）眼（yǎn）刺激試驗的差異

滴眼給藥毒性試驗（yàn）的設計

01、動物物種

根（gēn）據ICH M3指導（dǎo）原則（zé），一（yī）般毒性試驗需選擇兩種動物（ICH, 2009）。通常情（qíng）況下（xià），會從齧齒類動物（如（rú）兔或小（xiǎo）鼠）和非齧（niè）齒類動物（犬（quǎn）或猴（hóu））中各選（xuǎn）一種。然而，在過（guò）去十年間（2005~2016），經日本衛生勞動福利部（MHLW）批準，約九成的滴眼液在研發過程中，將兔作為開展滴眼給（gěi）藥毒性試驗的首選實驗物種，其次常用（yòng）的實驗物種是猴（幾乎全部是食蟹猴（hóu）），再然後是（shì）犬（見（jiàn）表2）。因此，滴眼給藥毒性試（shì）驗通常選擇兩種非齧齒類動物。不過，動物物種的選擇是根據具體情況而定的。因此，在評估某些藥物時，可能僅使用一（yī）個物種（比如兔或食蟹猴）。

表2 2005~2016日本滴眼液滴眼給藥毒性（xìng）試驗的獲批的動物物種 

注：信息來（lái）源於日本醫藥和醫療器械局（PMDA）主頁

近來發表（biǎo）的多篇文章從（cóng）眼部安全（quán）性評估的角度出發，討論了各個實驗物種的特點，並對不同（tóng）實驗（yàn）物種作了比較。各物種的特（tè）點如下。

兔

兔的眼球重量約為人眼的一半，眨眼（yǎn）頻率（lǜ）（每6分鍾一次）明顯低於（yú）人類的眨眼頻（pín）率（每5秒鍾一次）。此外，兔的角膜比人類的（de）角膜薄。基於這些特點，並（bìng）考（kǎo）慮（lǜ）到影響藥物角膜滲透能力的因素，有研究者預計（jì），在滴入滴眼（yǎn）液後，兔眼的藥物暴露水平相對較高。McDonald和Shadduck（1977）認為兔（tù）相較於（yú）其他實驗動物對眼刺（cì）激物更為敏感。使用兔進行試驗的（de）其他（tā）原因（yīn）還包括較低的動物成本以及基於（yú）大量（liàng）供試品積累（lèi）的曆史數據。

在進行滴眼給藥毒性試驗時，特（tè）別需（xū）注意選擇色素兔還是白（bái）化兔。由（yóu）於供試品能夠（gòu）與色（sè）素兔體內的色素結合，因此在毒性評估時，色素兔更具優勢。關於（yú）色素兔，荷蘭（lán）帶兔（tù）比新西蘭大白兔和新西（xī）蘭紅兔（F1代（dài）兔）更（gèng）常（cháng）用於滴眼給藥毒性試驗。Durairaj等人（2012）報告（gào）稱，人、食（shí）蟹猴、犬、豬、F1代兔和荷蘭帶兔的眼部黑色（sè）素含量存在差異，而且不同物種之間（jiān）眼睛各（gè）部分的黑色素含量也不同。另外，值得一提的是，荷蘭帶兔的眼球比新西蘭大白兔或日本白（bái）兔的小。

猴

盡管食蟹猴的眼球重量僅約為人眼的一半，但（dàn）其解剖（pōu）特征與人類相似。例如，食蟹猴（hóu）的（de）角膜（mó）和（hé）晶（jīng）狀體相對較小，眼底（dǐ）有黃斑。Shibuya等人（2015）建議將食蟹猴用作實驗動物，因為它（tā）們（men）的眼睛（jīng）有（yǒu）助於詳（xiáng）細評估藥物誘導（dǎo）的黃斑病變毒性。食蟹猴的眨眼頻率與人類相似。與人類一樣，食蟹猴既沒有瞬膜，也沒有哈氏腺，而兔、犬和豬則都有瞬膜（mó）和（hé）哈氏腺。食（shí）蟹猴和犬一（yī）樣（yàng），也用於（yú）係統毒性試驗。利用相（xiàng）關物種（zhǒng）可以獲得毒理學數據，彌合局部給藥和係統給藥在同一物（wù）種（zhǒng）中產生的結果差（chà）異。與人類相比，食蟹猴的眼組織黑色素含量相對較高。在猴類中，視神經退化常見於恒河猴（hóu）和食蟹猴，且（qiě）被認為是自發性（xìng）先天視神經病變。

犬和豬

針對特定目的飼養的比格犬的眼球重量約為5.5克，約為人眼（yǎn）重量的0.8倍，而豬的眼球大小接近人眼。從眼（yǎn）球的絕對尺寸來看，犬和豬在藥物局部效應評估方麵具有優勢，因為眼組織的厚度和（hé）長度是（shì）決定局部給藥藥物（wù）滲透性和分（fèn）布的重要因素（sù）。犬和豬的眼部解剖（pōu）特征相（xiàng）似，例如，與靈（líng）長類動物相比，它們的晶狀體在眼球中占據的體積（jī）相對較大。另一方麵，犬的脈絡膜上有毯氈層，而豬、兔或（huò）食蟹猴則沒有。目前，犬和（hé）豬不（bú）常用於滴眼給（gěi）藥毒性試（shì）驗，尤其是豬。然而，這類動物在滴眼（yǎn）給藥毒性試驗中仍有其獨（dú）特的優勢，理由如下：1. 基於上述解剖和生理特點（diǎn），模仿人體藥物分布的可能（néng）性較高。2. 與兔和（hé）食（shí）蟹猴（hóu）相比，由於犬和豬（zhū）的體型相對較（jiào）大，通過係統給藥出現的藥物反應更少（shǎo）。

02、性別

根據一般毒性試驗指導原則（衛生福利部，1999），滴眼給藥毒性試驗應在（zài）兩種性別的動物上（shàng）進行。人（rén）類、恒河猴和兔的眼軸長度存（cún）在性別（bié）差異，但眼球尺寸的性別差異卻極其微小（xiǎo）。Wagner等人（2008）研究了健康人眼和患病人眼的性別差異（yì），認為性激素影響了（le）不同性別在患病狀態下的淚腺係統、眼瞼和眨眼頻率、以及（jí）角膜的解剖和特征。一般而言，幹眼流行病學研究表明女性幹眼發病率比男性高。然而，實驗動物的眼睛是否存在（zài）顯著的性別差異尚不明確。是否在（zài）滴眼（yǎn）給藥毒性試驗中使用兩（liǎng）種性別，尤其僅進行眼毒性評估的試（shì）驗，仍有待進一步討論。

03、給藥

劑（jì）量和濃度

根據ICH M3指導原則（ICH，2009），一（yī）般毒性試驗的高劑量水平設定為最大耐受量（MTD）、最大給藥量（liàng）（MFD）或人體暴（bào）露量（liàng）的50倍。這（zhè）一設定原則同樣適用於滴眼（yǎn）給藥毒性試驗。在某些情況下，高劑量（liàng）水平可以基於局部耐（nài）受性預試驗的結果來確定（dìng）。然而，在（zài）大多數情況下，滴眼給藥毒（dú）性試（shì）驗的高劑量水平是根（gēn）據MFD設定的，主要是由於製劑（jì）製備的（de）某些內在因素。

供試品的角膜滲透性主要取（qǔ）決於製劑的特性（xìng）。為了獲得（dé）有意義的（de）風險評估結果，權威（wēi）性滴眼給藥毒性試驗（例如首次人體試驗（yàn）之前開展（zhǎn）的GLP試驗）所用的供試製劑應與臨床試驗所用的製劑一致或相近。供試品的濃度主要是根據其在製劑中的溶解度來定義的（de）。至於製劑的調整，其他特性（如滲透壓、pH值和賦形（xíng）劑）也十分重要。滴眼液製劑的酸（suān）堿度應（yīng）在可接（jiē）受的生理範（fàn）圍內。選擇（zé）防腐劑時（shí），需避免其濃度達到引起毒（dú）性反應的水平。例（lì）如，有研（yán）究者發現，眼科製劑中常用的防腐劑苯紮氯銨在局部給藥時會誘（yòu）發角膜變化。因此，眼科製劑（jì）中防腐劑的濃度是有限製的（de）。因此，在大多數情況下，滴眼給藥毒性試（shì）驗所（suǒ）設的最高劑量水平是（shì）基（jī）於受試製（zhì）劑的（de）最（zuì）大給藥量，而非供（gòng）試品本身的特性來決定的。

滴眼體積

兔子的眼瞼較為（wéi）鬆弛，結膜囊較（jiào）大，因此能容納較大的（de）滴眼液體積。根據OECD眼刺激試驗指導原則，兔子的滴眼體（tǐ）積為（wéi）0.1 mL（OECD, 2012）。該體積約為臨床標準（zhǔn）滴眼液（yè）用藥體積（約0.04 mL）的兩倍。從經驗來看，不（bú）同物種的最大滴眼體積並（bìng）不相同。例如，比（bǐ）格犬（quǎn）和（hé）兔（tù）子的最大可行體（tǐ）積相似，而食蟹猴的最大可行體積則是比格犬和兔子的兩倍多。

需注意的是，眼部暴（bào）露量並不會隨著滴眼體積的增加而成比例（lì）增加，因為部分多餘（yú）的液體會通過鼻淚管（guǎn）流失。Lambert等（1993）假（jiǎ）定在眼刺激試驗中，如果滴眼體積為0.01 mL（建（jiàn）議供試體積的（de）十（shí）分之一），藥物與人眼刺激感受的相關性更佳。因此，滴眼給（gěi）藥毒性試驗的滴眼體積可能需進一步討論。增加滴眼體積並不能有效提高眼部暴露量，反而可能導致係統暴露量增加，甚至引發意料之外的係統毒性反應。

單眼/雙眼（yǎn）給藥

供試品是單眼給藥（yào）還是（shì）雙眼給藥需慎重考（kǎo）慮。從動物福利的角（jiǎo）度出（chū）發，若（ruò）無特殊原因，應將供試品滴入單側眼睛。如一隻眼（yǎn）給予供試品，另一隻眼則不給藥（即不接觸供試品），或（huò）給予對照（zhào）品（例如（rú）溶媒製劑）作為對照。然而，嚴格來說，對照（zhào）眼由於（yú）係統循環的影響，可能（néng）也會接觸到供試品。因此，在評（píng）估對照眼的結果時，應該考慮到（dào）這一潛在的接觸因素。

給藥頻率

在標準（zhǔn）的口服或靜脈給藥一般（bān）毒（dú）性試驗中，通常（cháng）每天給（gěi）藥一次；而在滴（dī）眼給藥毒性試驗中，通常一天（tiān）給藥多次。非臨床試驗的滴眼頻率通常高於臨床試驗的給藥頻率。例如，非臨（lín）床試驗中可能每天滴眼4次（cì），而臨床試驗中則每天滴眼2次。滴眼給藥毒性試驗設定較高的給藥（yào）頻率，旨在獲得更高的重複暴露量，特別是在供試品的生化（huà）特征導致最（zuì）大藥物濃度難以增加（jiā）時更為重要。Chrai等人（rén）（1974）報告稱，如果兩次滴（dī）眼間隔5分鍾，就能有效地增加兔的眼部暴露量。許（xǔ）多滴眼給藥毒性試驗的給（gěi）藥頻率是臨床給藥頻率的1.5到2倍。然而，給藥過於頻繁雖可提（tí）高暴露水平，但也增加操作的次數，從而增加動物保定的頻率，這（zhè）可能導致（zhì）動物應激，進而（ér）引發倫理問題。因此，在（zài）設計滴（dī）眼給藥毒性試驗時，需在提高（gāo）暴露水平和減少動物應激之間找到平衡點，以確（què）保試驗的科學性和倫理性。

04、眼及附屬組織檢查

常規/標準眼科學檢查

滴眼給藥毒性試驗目前尚無（wú）統一的眼部和係統檢查項目。OITSs的眼科（kē）學檢（jiǎn）查是（shì）基於係統藥物一般毒性評估指（zhǐ）導原則進行的，涵蓋了眼前節、眼內介質和（hé）眼底等所有組織的檢查（ICH, 1999）。然而，由於滴眼給藥直接作用於眼部，滴眼給藥毒性試（shì）驗的眼（yǎn）科學檢查更加詳（xiáng）細，涵（hán）蓋的檢查項目也更多。Weir和Wilson（2013）列出了非臨床眼毒性試驗的標準眼部安全性終點（diǎn），這些終（zhōng）點具有重要的借鑒意義。檢查項目包括：大體觀察、裂隙燈（dēng）生物顯微（wēi）鏡檢查、眼底檢眼鏡檢（jiǎn）查、眼壓測量、視網膜電圖和組織病理學。

基（jī）於相關指導原則和知識（shí），表3總結了滴眼給藥毒性試驗的常規及可選眼科檢查項目。由（yóu）於眼前節（jiē）的供試品（pǐn）濃度較高，因此對眼前節（jiē）進行觀察和檢查尤為重要。除（chú）標準的大體觀察外，采用評分方法進行詳細觀察對於評估眼毒性的嚴重程度非常關鍵（jiàn）。例如，Draize評分法用於角膜、虹膜（mó）和結膜的大體觀察。McDonald Schadduck評分（fèn）和Hackett-McDonald評分常應用於滴眼（yǎn）給藥毒性試驗中，二者對裂隙燈顯微鏡（jìng）檢查結果進行評分。特別是（shì），Hackett-McDonald評（píng）分（fèn）能對眼睛進行全麵評估，包括對晶體和瞳孔光反射的評估。

表3 滴眼給（gěi）藥毒性試驗的常規或可選眼科學檢查

常規檢查包括利用檢眼鏡對玻璃體和眼底進行觀（guān）察。使用直接檢眼鏡和（hé）間接檢眼鏡可詳（xiáng）細（xì）檢查眼底（dǐ）。本原則建議，除拍照外，還應簡述檢查結果並記錄，並將這些記錄與相應的詳（xiáng）細記錄一同（tóng）保存（cún）。

眼壓是衡量前房（fáng）角功能（néng）變化的重要參數（shù）。FDA指導原則提（tí）到了使用眼壓計的方法（FDA/CDER，2008）。在（zài）非（fēi）臨床毒性試驗中，常用扁平眼壓計、回彈式眼壓（yā）計或（huò）空（kōng）氣式眼壓計來測量眼（yǎn）壓。在滴眼給藥（yào）毒性試驗中，使用眼壓計有幾點注意事項。首先，為了獲得準確的眼壓值，有必（bì）要使動（dòng）物適應眼壓計。在測量之前，如果動物沒有適應眼壓計，通常情況下測出的眼壓值會偏高，從而導致無法正確判斷藥效（xiào）。其次，由於儀器會接觸角膜表麵，眼壓測（cè）量操作可能會在某種程度上損（sǔn）傷角膜上皮細胞。因此，應慎重決定檢查的組別及檢查順序，以避免眼部（bù）過度應激，並防止過度應激影響（xiǎng）其他（tā）結果的（de）解讀。

通過全視野視網膜電圖檢查（ffERG）可檢（jiǎn）測視網膜的功能變化。理想的做（zuò）法是（shì）使用國際臨床（chuáng）視覺（jiào）電生理協會（ISCEV）建議的方法，因（yīn）為此方法可在進行全視野視網膜電圖檢查時識別視錐細（xì）胞和（hé）視杆細胞的變化。然而，此方法不適用於在有限時間內對大（dà）量動物進行檢查的情（qíng）況。ISCEV方法擬（nǐ）用於隨診檢查，可能僅適用於ERG檢查發現異常的情況。例如，Penha等人（2010）報告稱，角膜（mó）混濁或晶體混濁會影響光線到達（dá）視網膜，而麻醉也會影響全視（shì）野視網膜電圖的檢查結果。

可選檢查

關於淚膜檢（jiǎn）查，Schirmer試驗和酚紅線試驗用於淚液體積的（de）定（dìng）量分析。進行Schirmer試驗和酚紅線試驗時，分別使用無毒濾紙或棉線浸潤於pH指（zhǐ）示劑酚紅溶液中，然後插入結膜囊內進行淚膜檢測。淚膜（mó）的其他臨床檢（jiǎn）查包括淚膜破裂時間。此前已有研究者報（bào）告了犬和兔的淚膜破裂時間，這些測試能夠揭示淚腺的功能狀（zhuàng）態（tài）。此外，眨眼頻率也可以（yǐ）間接（jiē）說明供試品是（shì）否對角（jiǎo）膜產生了刺激。

由於眼科成像技術的進步，現在能檢測出常規眼科學檢查（chá）難以察覺的變化。例如，角（jiǎo）膜共焦顯微鏡檢查能夠（gòu）捕捉到角膜上皮的細微（wēi）變化；角膜內皮顯微鏡檢查能夠觀察到角膜內皮的形（xíng）態和密度變化；光學相幹斷層掃描（OCT）對於視網膜的觀察非常有力。這些成像技術均可（kě）用於滴眼給藥毒性試驗中的動物檢查，能夠生成（chéng）高分辨率的圖像，滿足組（zǔ）織病理學檢查的要求。

滴眼給藥毒性試驗的其他常用眼前（qián）節檢查包括定量測量角膜厚度（dù）的測厚儀和定量（liàng）測量前房房水閃輝的激光房水（shuǐ）閃（shǎn）光（guāng）細胞儀。如果眼後節的視網膜出現局部異常，多焦視網膜電圖（mfERG）能夠捕捉到相應的電生理信號。利用眼底（dǐ）血管熒光（guāng）造影能夠（gòu）觀察（chá）到視網膜和（hé）脈絡膜的原有（yǒu）血管及新生血（xuè）管的滲透性。

Kontadakis等人（2014）指出，淚膜中的細胞因子和生長因子作為生物標記物，能預示眼（yǎn）表疾病。有（yǒu）研（yán）究者報告稱，血清細胞因子是預示老（lǎo）年黃斑變性的生物標記物。生物標記物能用於（yú）非侵入性方式觀察（chá）藥物誘導的眼毒性反應。然而，目前這（zhè）樣的生物標記（jì）物（wù）數量仍（réng）然有限。反過來，上述的各種眼部成（chéng）像技術可能可替代生物（wù）標記物，用於（yú）觀察和研究人（rén）和動物的眼毒性。

05、眼及（jí）附屬組織的病理學檢（jiǎn）查

組織病理（lǐ）檢查是滴眼給（gěi）藥毒性（xìng）試（shì）驗的重要組成部分。最近，多篇文獻綜述一致強調了（le）組（zǔ）織病理學檢查在藥物評估中的重要性。在滴眼給藥（yào）毒性試驗中，供試品（pǐn）的最大暴露量不僅（jǐn）出現（xiàn）在角（jiǎo）膜上皮，還（hái）出現在結膜和排泄係統，包括鼻淚管的粘膜和鼻腔。因此，需要特別注意細致檢查這些組織。淚腺、哈氏腺（若有）、鼻腔和瞬膜（若有）也應進行組織病理學檢（jiǎn）查。為了準確地進行組織病理學評估分析，必須嚴格考量組（zǔ）織病理切片的質量。如今已有多篇關於這（zhè）一方麵（miàn）的文章發（fā）表，詳細闡述了切片的各種技術考量。