齧齒類實（shí）驗動（dòng）物是使用最多（duō）的實驗動物，其微（wēi）生（shēng）物質量控製一直是實驗動物設施管理者的工作重點（diǎn）。每個設施都有自己的動物健康監測方案，其中哨兵（bīng）鼠（Soiled Bedding Sentinels, SBS）長期以來應用最為廣泛。但由於哨兵鼠方案本身存（cún）在（zài）的一些缺點，常常無（wú）法及時有效地監（jiān）測微生物汙染的發生，且需要額外（wài）使用動物，並（bìng）不符合3R原則（詳見本號前期文章：哨兵鼠設置，你想知道的（de）都在）。

近幾年，國際上有越來越多（duō）的設施將環境樣本PCR檢（jiǎn）測（cè）（Environmental Health Monitoring, EHM）作為哨（shào）兵鼠方案的補充或替代方案，以便更及（jí）時靈敏地監測（cè）動物（條件（jiàn））致病微生物感染和攜（xié）帶（dài）狀況。我（wǒ）國也有少數設施采取這種監測方案。該方案不僅提高了檢測的敏感性，還減少了動物使用數量，同時在哨（shào）兵（bīng）鼠設置和飼（sì）養（yǎng）上的時間和金錢成（chéng）本也得到了（le）節省。隨著（zhe）該方（fāng）法的不斷優化和普及，哨兵鼠方案（àn）在歐美多（duō）國有逐漸被取代（dài）的趨勢。本文就簡要介紹一下EHM方案。

1、EHM方案的采樣方式

EHM方案（àn）最早采用無菌（jun1）拭子擦拭附（fù）著在出風口的粉塵（Exhaust Air Dust，EAD），或用特定大小的紗布或濾紙固定（dìng）在出風口初效過濾器上（shàng）收集粉塵。後（hòu）來泰尼百斯、Allentown等籠具公司設計（jì）了專（zhuān）門的采樣口/卡槽並配套使用采樣卡，使得樣本采集更加簡便，並標準化。這兩種方法都需要廢氣排出時不能在籠盒水（shuǐ）平進（jìn）行空氣過濾。目前在美國、加拿（ná）大等國家這兩種方法都是被普遍使用（yòng）的采樣方式。

近（jìn）幾（jǐ）年，將（jiāng）植（zhí）絨拭子、濾紙等介質放入髒墊料盒中代替哨兵鼠，通（tōng）過充分接觸可能（néng）存在的病原微生物進行采樣的方法也被逐（zhú）步采用。該方（fāng）法不僅適用於所有設計形式的籠具，同時還可有效避免由於籠架清洗不充（chōng）分所殘留的核酸引起的假陽性（xìng）結果。

不論是使用哪種采樣方式，獲取的（de）樣（yàng）本都是用PCR方法檢測目標病原體核酸，而（ér）由於PCR方法的高敏感性，因此（cǐ）足以檢測到（dào）樣本中的微量核酸。

Jensen, JAALAS, 2013

Miller, JAALAS, 2016

Mahabir, Lab Anim., 2018

Pettan-Brewer，JAALAS, 2020

Varela，JAALAS, 2022

2、檢測結果的準確性

在綜合分析了已公開發表的33篇文獻（xiàn）後發現，髒墊料哨（shào）兵鼠（shǔ）方案對各種（zhǒng）病原體的總檢出率約76%，而EHM的檢出率約96%。（詳見表1）

目前小鼠肝炎病毒、小鼠細小病毒（dú）、仙（xiān）台病毒、嗜肺巴斯德杆菌、螺杆菌、鞭毛蟲、蟯蟲及蟎蟲等多種病原體都已證實可在EAD樣本中準確檢出。特別是其中有些病原體在髒墊料哨兵鼠方案會漏檢，但卻可（kě）以成功通過EHM檢測到（dào），例如仙台病毒（dú）、嗜肺巴斯德杆菌、螺杆菌、鼠阿米巴、蟯蟲等。但是也有（yǒu）一些病原體，尚未證實可以檢出，或不同研究顯示其（qí）檢測效果尚有爭議，例如輪狀病毒、鏈球菌等。

表1：不同病原體在髒墊料哨兵鼠和環境樣本中的檢出情（qíng）況

*：檢出某病原體的（de）文章數量/評估某病原體的文章數量

3、歐美實驗動物設施EHM使用（yòng）情況

一項覆蓋美國、加拿（ná）大、歐洲、英國等多個國家和地區的111個（gè）動物（wù）設施的調查（chá）報告顯示（shì），在大小鼠的月度和季度常規健康監測中（zhōng），有11%的設施單獨使用EHM，41%的設施（shī）單獨使用髒墊料哨兵鼠（shǔ），46%的設施使（shǐ）用多種方（fāng）案組合，此外有2%的設施（shī）不進行常規健康監測。

對於檢疫期齧齒類動物，由於有更（gèng）高的時效性（xìng）要求，有更多人會選擇EHM方案，在被調查的（de）111個設施中，63%的機（jī）構單獨（dú）使用EHM，15%的設施單獨使用髒（zāng）墊料哨兵鼠（shǔ）方案，14%的設施使用多種方（fāng）法組合（hé），還有8%的設施不（bú）檢測檢疫期動物。

由以上數據可（kě）以（yǐ）看（kàn）出，目前（qián）在檢疫檢測中（zhōng），由於EHM可以更快反饋結果，因而使用更廣泛，但在（zài）常規健（jiàn）康監測中用EHM將髒墊料哨兵（bīng）鼠完全替代的還是少數。但業內人士普遍相（xiàng）信，隨著越來越多（duō）的數據支持、廣泛的（de）宣（xuān）傳和專業（yè）指導，使用EHM方案的設施數量會越來越多。

4、實施EHM監測前應該評估的內容

籠架和籠盒構造可能是在實施EHM方案前（qián）最需要考（kǎo）慮的因素。如何采樣、采樣位置選擇將直接影響監測效果，因此建議（yì）對於不同類型、不同廠家的籠具都應該充分驗證采樣時間、方式和位置（zhì）後再（zài）正式使（shǐ）用。

如果設施中曾經發生（shēng）過某種微生物汙染，或所使用的墊飼料中殘留某種微生物的核酸，那籠架出風口粉塵樣本中就很可能存在其核酸片（piàn）段，這就會造成假（jiǎ）陽性結果。例如，某設施（shī）在做驗證時發現在用出風（fēng）口粉塵樣本檢測時可以檢測到大量綠膿杆菌（jun1）核酸，但最終證實動物並沒有感染，環境中也沒有活（huó）菌，而是所使用（yòng）的飼（sì）料中存在綠膿杆菌核酸，這種混（hún）淆會耗費大量精力和成本。

對於多數設（shè）施來說，使用哨兵鼠方案則可以通過購（gòu）買商業化試劑進行自（zì）檢，但如果使用（yòng）EHM方案，則需要進行PCR自檢（jiǎn），那很可能由於方法驗（yàn）證不充分、實驗室條件不適宜、氣（qì）溶膠汙染等多種（zhǒng）因素造成實驗結果的不可靠。如果將EHM樣本送檢專業第三方檢（jiǎn）測機構，檢（jiǎn）測成本（běn）則（zé）要明顯高於哨兵（bīng）鼠檢測。盡管在哨兵鼠購買、飼養、樣（yàng）本采集等方麵（miàn）需要消耗更多資金和勞動力（lì）成本（běn），甚至經過折算這部分（fèn）成本是高於支出的檢測費（fèi）的，但相較於檢測費，這些成（chéng）本更為“隱形”。

由於標準更新的周期漫長（zhǎng），目前國標GB/T 14926中檢（jiǎn）測病原微生（shēng）物的主要方法是血清學方法、培養法和（hé）鏡檢法，而極少提及分子生物學方法，這也使得不（bú）同實驗室間方法不統一（yī），使得其推廣應用及不同機構間互認的阻礙增加。

展望

總而言之，目前在美國、加拿大、歐洲等國家和地區，EHM的驗證和應用（yòng）越來越廣泛，已經有少數設施完全取消（xiāo）了髒墊（diàn）料哨（shào）兵（bīng）鼠的使用，每年可減少數萬隻哨兵動物的使用。我國（guó）開展驗證和應（yīng）用EHM方案的機構數（shù）量還十分稀少，但是也逐漸（jiàn）有越（yuè）來越多的設施管理者開始關注並嚐試。所以短期內髒墊料哨兵鼠還是會被廣泛應用，但是隨著管理人（rén）員對結果時效性、敏感性的要求的（de）提高和方（fāng）法的充分驗（yàn）證，EHM一定會被更多使用（yòng），並逐步替代哨兵鼠方案。

參考文獻：

1. Luchins KR, Gates KV, Winn CB, Manuel CA, Pettan-Brewer C, Foley PL, Peterson NC, Garner JP, Hanson W, LaFollette MR. A Cross-sectional Survey on Rodent Environmental Health Monitoring Practices: Benchmarking, Associations, and Barriers. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2023 Jan 1;62(1):64-73. doi: 10.30802/AALAS-JAALAS-22-000086. PMID: 36755202; PMCID: PMC9936849.

2. https://na3rc.sharepoint.com

3. Winn CB, Rogers RN, Keenan RA, Gerwin PM, Matthews KA, Ramirez JA, Bennett TE, Perkins CL, Henderson KS. Using Filter Media and Soiled Bedding in Disposable Individually Ventilated Cages as a Refinement to Specific Pathogen-free Mouse Health Monitoring Programs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2022 Jul 1;61(4):361-369. doi: 10.30802/AALAS-JAALAS-22-000013. Epub 2022 Jun 24. PMID: 35750479; PMCID: PMC9674011.

4. Mailhiot D, Ostdiek AM, Luchins KR, Bowers CJ, Theriault BR, Langan GP. Comparing Mouse Health Monitoring Between Soiled-bedding Sentinel and Exhaust Air Dust Surveillance Programs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2020 Jan 1;59(1):58-66. doi: 10.30802/AALAS-JAALAS-19-000061. Epub 2019 Dec 20. PMID: 31862019; PMCID: PMC6978580.

5. de Bruin WC, van de Ven EM, Hooijmans CR. Efficacy of Soiled Bedding Transfer for Transmission of Mouse and Rat Infections to Sentinels: A Systematic Review. PLoS One. 2016 Aug 12;11(8):e0158410. doi: 10.1371/journal.pone.0158410. PMID: 27518654; PMCID: PMC4982683.