最近驚聞一位朋友因患一種名為肝豆狀核變性的罕（hǎn）見病（bìng）而離世，突感罕（hǎn）見病並不罕見，它往往就（jiù）在我們身（shēn）邊。因筆者對肝豆狀核變性研究有所（suǒ）涉獵，本（běn）文將對該病及其動（dòng）物模型作簡要介紹。

01、首（shǒu）次（cì）發現及致病機製

肝豆狀核變性又（yòu）名Wilson病(Wilson’s disease，WD) ，1912年首次由Samuel Kinnear Wilson博士描述。該病表現為“漸進性豆狀核退化”，在患者（zhě）的肝髒和大腦等器官中發現了過量的銅，該病在全球的患（huàn）病率約為1/30000。經過多年（nián）研究（jiū），肝豆狀核變性（WD）的發病機製已經研究的較為清楚，它（tā）是一種常染色體隱性遺傳銅代謝障礙疾病[1]。1993年三個獨立研究（jiū）小組幾乎（hū）同時發現了ATP7B基因（yīn）為Wilson病的致病基因。該（gāi）基因編碼銅轉運P型 ATP酶 ( copper-transporting P-type ATPase，ATP7B)[2]，WD患者攜帶發生突變的ATP7B基因，血（xuè）清銅藍蛋白合成（chéng）及正常的銅（tóng）代（dài）謝過程發生（shēng）障（zhàng）礙，過量的銅沉（chén）積在組織器官中，如肝髒、大腦、腎（shèn）髒、角膜中，其中最常受累的是肝髒和神（shén）經係統[3]。

圖1.ATP7B蛋白（bái）結構圖

圖注：N-端包含六個結合銅的金屬結合結構域（MBD1-MBD6，青色）；參與Cu配位的殘基在膜內的位置為CPC、YN和（hé）MXXXS；位於C末端的兩個亮氨（ān）酸（suān）基序（1459LL和1487LL）對胞吞作用和TGN從質膜重新定位至關重要[4]。

02、臨床（chuáng）表現及（jí）診斷

WD患者在臨床表現（xiàn）上包括嚴重程度不等的肝損傷、持續性（xìng）血清轉氨酶升高、急性或慢性肝炎、代償期（qī）或失代償期肝硬化和暴發性肝功能衰竭等[5]。神經係統的（de）表現以（yǐ）椎體外係病變症狀為主，包括僵硬（yìng）、震（zhèn）顫、運動遲緩、構音障礙（ài）、吞咽障礙、舞蹈症狀、癲癇發作等，精神症狀包括躁（zào）狂、性格改變、抑鬱等[6, 7]。此外腎髒、血液（yè）係統及骨關節等器官（guān）係統（tǒng），也會出現相應的（de）臨床症狀和體（tǐ）征。

患（huàn）者出現以下一些症狀或指標可供臨床診斷：

1. 角膜K-F環是某些WD患者一個比較明顯的特征。K-F環為角膜邊緣的黃綠色或黃（huáng）灰（huī）色色素環，一般在手電筒側光照射下肉眼可見，7歲以（yǐ）下患者一般無（wú）法檢（jiǎn）出角膜K-F環。

2. 肝（gān）脾檢查：肝功能（néng）血清轉氨酶（méi）、膽紅素升高和（或）白蛋（dàn）白降低；肝脾B超：常顯示肝實質光點增粗、回聲增強甚至結節狀（zhuàng）改變（biàn）；部分（fèn）患（huàn）者脾髒腫（zhǒng）大；肝髒MRI檢查常顯示肝脂質沉積（jī）、不規則結節及肝葉萎縮等。

3. 采用銅代謝相關生化檢查，銅藍蛋白<120mg/L，24小時尿銅≥100μg。

4. 顱（lú）腦MRI檢（jiǎn）查主要表現為殼核、尾狀核頭部、丘腦、中腦（nǎo）、腦橋及小腦T1低（dī）信號（hào）、T2高信號，少數情況下可出（chū）現T1高信號或T1、T2均低信號。

5. 基因篩（shāi）查：對於臨床證據不（bú）足但又高度（dù）懷疑WD的（de）患者，篩查ATP7B基因致病變異對診斷具有指導意（yì）義。

圖2. 角膜邊緣黃色渾濁（zhuó）的K-F環

03、ATP7B突變類型及地理分布

ATP7B基因突變在不同種族和地域中存在遺傳異質（zhì）性（xìng）。歐洲人（rén）群最常見的突（tū）變類（lèi）型是14號外顯子（zǐ）上的 H1069Q突變，在意大利、瑞典和羅馬尼亞等地多見，臨床主要以錐體外係症狀為主（zhǔ），如震顫、肌張力障礙、精神症狀等（děng）。亞洲人群最常（cháng）見的突變類型是 8號外（wài）顯子（zǐ）上的錯義突變R778L，以中國、韓國和（hé）日本最多見，臨床以肝髒方麵症（zhèng）狀為主，如肝功能異常、肝硬化、肝脾大等；其餘常見的還有 P992L、Q1399R等（děng）[8]。

04、肝豆（dòu）狀核變性動物模型

1. “毒乳”( toxic milk，TX)小鼠

肝豆狀核變性（xìng）動物模型中最有名的是一種“毒乳”( toxic milk，TX)TX小鼠。 “毒乳”小鼠（shǔ）這一名稱源自雌性純合子TX小鼠乳汁中缺乏銅，因此其（qí）哺乳的幼（yòu）鼠在2周（zhōu）左右時會由於銅缺乏而死亡。後續研（yán）究證（zhèng）明“毒乳”為（wéi）ATP7B基因突變（biàn）小鼠。

TX小鼠又分為兩種，一種是1974年由Harold Rauch在DL近（jìn）交係小鼠F68代中發現的自（zì）然突變，後（hòu）來（1996年）被鑒定為ATP7B基因外顯子20中4066位（wèi）的A到G堿基變化，導致第八跨膜區（qū）M1356V（甲硫氨酸to纈氨酸）的改變。TX鼠於第3周開始出現銅在髒器的沉積，首先是肝髒和腦，以肝髒為重，至第4個月銅沉積最為顯著，可（kě）達對照（zhào）組（zǔ）的60~80倍。同期（qī）腎髒亦有大量沉積。這種由肝至腦再到腎的銅沉積過程（chéng）與WD患者的一般臨床病程相似[9]。

另（lìng）一種TX小鼠是1987年在傑克遜實驗室的C3H/HeJ群體中出現的自然突變品係TX-J小鼠，現對外出售，編號001576。該（gāi）突變小鼠是ATP7B基因（yīn）外顯子8中2135位的G到A的堿（jiǎn）基突變（biàn）。與TX小鼠相似，TX-J小鼠與WD患者以相似的方式在肝髒中（zhōng）積累銅，成年純合子TX-J小鼠會發展（zhǎn）為（wéi）肝硬化。

TX和TX-J小鼠不能完全模（mó）擬WD患者，其角膜無K-F環；與WD患者的肝髒損傷也有顯著差異；且（qiě）沒有關（guān）於人類WD母親的嬰兒銅缺乏現象的報告；另外TX小鼠缺乏明顯（xiǎn）神經係（xì）統症狀，TX-J小鼠也（yě）隻有輕微的行為異常（cháng）。但TX和TX-J小（xiǎo）鼠ATP7B mRNA的轉錄水平沒有（yǒu）明顯改變且ATP7B基因功能部分保留，並具（jù）有與WD患者相類似（sì）的病理過程和銅生化特征，同時也由於其容易獲得，是目前使用最多的WD動物模（mó）型之一，廣泛應用於一些治（zhì）療藥物的試（shì）驗（yàn）。

2. ATP7B基（jī）因修飾小鼠（shǔ）

利用同源重組技術或CRISPR基（jī）因編輯技術敲除ATP7B基因第2外顯子獲得的ATP7B-/-基因敲除小鼠也越來越多（duō）的（de）被用於WD研究（jiū）。ATP7B-/-基因敲除小鼠具有與人類WD和TX小（xiǎo）鼠相似的銅沉積（jī）表型，但（dàn）與TX鼠模型相（xiàng）比發病較早且肝損傷更嚴重，肝炎、壞死性炎症、膽管增殖、纖維化，甚至後續的腫瘤發生等症狀都比TX鼠更接近（jìn）人類WD的（de）肝髒病理結果。

隨著基因編輯技術的進展，采用基因編輯工具CRISPR/Cas9+ssDNA[10]，或（huò）采用堿基編輯（Base Editor）、先導編輯（Primer editor）技術，結合胚胎操作術可以較輕鬆地在小鼠ATP7B基因上構建與人類WD同源的突變位點。理論上可以獲得更接近人類WD特征的小鼠模（mó）型（xíng）。

3. LEC(Long–Evans Cinnamon)大鼠

LEC大鼠是一種近交係突變大鼠，最初是從Long–Evans大鼠群體中（zhōng）分離出來的，它的ATP7B基因在3’端編碼區缺失了900個堿基，以及下遊未翻譯區缺（quē）失了約400個堿基。LEC大鼠（shǔ）主要（yào）表現出（chū）自發性肝銅異常（cháng）積聚伴隨低血清銅和低銅（tóng）藍（lán）蛋白，大約4月齡時出（chū）現暴發（fā）性肝炎或暴發性肝衰竭、轉氨（ān）酶和膽紅素（sù）升高，部分或大量肝細（xì）胞壞死，病死率至少30%～40%，存（cún）活下來的（de）大鼠多在12月齡時發生肝纖維化並伴有肝細胞癌和膽管癌。由於肝病進展迅速，LEC大鼠特別適合幹預治療研究，如各種排銅絡合劑和（hé）幹細（xì）胞治療研究等。

圖3. LEC(Long–Evans Cinnamon)大鼠

4. 其他大型哺乳動物模型（xíng）

一些大型哺乳動物在銅代（dài）謝方麵也存（cún）在遺傳（chuán）缺陷，均表現出（chū）銅在肝髒中積累和銅毒性，例（lì）如犬(杜賓犬、拉布拉多尋回犬、貝靈頓梗犬（quǎn）Bedlington Terrier)和北羅納德賽羊等。然而這些大型哺乳動物銅代謝方麵的遺傳缺陷與人類WD並不相同，如貝靈頓梗犬（quǎn），導致其肝銅積（jī）累的遺傳缺陷是由（yóu）於COMMD1（MURR1）基因39.7kb的刪除，而非ATP7B基（jī）因，故作為（wéi）人類WD模型的作用有其局限性[11, 12]。若能在大型哺乳動物甚至非人靈長（zhǎng）類動物的ATP7B基因（yīn）中引入突變，或將造就更好模擬人類WD的動物模型。

05、肝豆狀核變性的（de）治（zhì）療

在目前的治療方案中（zhōng），WD患者需進行終（zhōng）生治療，主要目標為治療銅過載。基（jī）本原則包括低銅飲食：避免或限製富含（hán）銅的食物，如肝髒（zāng）、水生貝殼類動物、堅果、巧克力、豆類、蘑菇等。藥物治療方麵以青黴胺、曲恩汀為代表的金（jīn）屬絡合劑增加銅的排除，以鋅劑為代（dài）表的藥物減少銅的吸收。治療越早越好，患者通常不能停藥，因為治療中斷（duàn）很可能導致失代（dài）償性肝損傷及神經不可逆損傷。

值得注意的是WD的藥（yào）物治療有一定的局限性，除需（xū）要終生治療外，約（yuē）1/3 WD患者用藥期間會出現與藥物相關的不良事件，導致不（bú）得不更換藥物（wù），甚至可能導致治療失敗（bài），WD晚期導致的肝衰竭或失代（dài）償期肝硬化（huà）需要進行肝移植（zhí），這可能（néng）是最（zuì）後的常規（guī）治療手段。

鑒於WD是非常明確的由ATP7B基因突變所致的疾病，因此基因治療或許有廣闊的（de）前景。目前已有基於動物模型的WD基因治（zhì）療研究。如Murillo等（děng）在研究中（zhōng）用編碼人ATP7B cDNA的AAV8載體轉導到ATP7B-/-小鼠（shǔ）模型的肝髒，發現治療後血清轉氨酶降低，尿銅排泄量減少，血清全血漿蛋白（bái）的正常化（huà）[13]。此（cǐ）外，2019年Liu等通過CRISPR/Cas9替換了小鼠模型中ATP7B基因的第8外顯子[14]；2020年（nián）Michael等使用CRISPR/Cas9+ssODN的方法糾正人類細胞（bāo）係中的ATP7B點突變[15]。筆者嚐試用一種（zhǒng）ABE堿（jiǎn）基編輯器輸入到（dào）TX-J小鼠（shǔ）肝髒，觀察到了小鼠血清轉氨酶降低，以及低比例的肝（gān）細胞ATP7B點突變被糾正（zhèng）（數據不展示（shì））。總之，基（jī）因治療的進展為WD患者帶來了希望，但基（jī）因治（zhì）療還處（chù）於基礎研究到臨床研究轉化的階段，還有很（hěn）多不（bú）成（chéng）熟的地方需（xū）要不斷完善和革（gé）新（xīn）。期望它將來能成為治療肝豆（dòu）狀核變性的一線療法。

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