2021年，经济合（hé）作与发展组织（OECD）正式发布了一项具有里程碑意义的测试指南——第（dì）497号（TG 497），首次将一套完整的综合体外测试方案纳入国际毒理（lǐ）学评价体系，该方案用于化学（xué）品的皮肤致敏性评估，被视为可完全替代动物实验。紧接着，OECD于2022年又发布了（le）另一项综合体外测试方案TG 467，用于评估眼部（bù）腐蚀与刺激。尽管目前仅有这两项指南作为完全（quán）替代相应动物（wù）实（shí）验的（de）方案被纳（nà）入官（guān）方毒理测试评价体（tǐ）系，但它们的推出仍标志着在部分领域，非动（dòng）物方法已（yǐ）由“辅助性（xìng）工具”跃升为（wéi）决策层面的主导（dǎo）手段，实现了特定毒理终（zhōng）点的完全替代（dài）。但正如TG 497的成功案例所揭示的那样，实（shí）现（xiàn）“完全替代”的（de）道路并非坦途（tú）——每一个被采纳的替（tì）代方案都需要在对生物机制深入理解的基础上，实（shí）现方法的标准化、完成多中心（xīn）验证及确保替代方案与人体（tǐ）真实反应的高度一致性。因此，目前替代成功更多是个别突破而非（fēi）普遍现象。在了解TG 497前，先简要了解下皮肤致敏（mǐn）的过程和机（jī）理：化合物引发皮（pí）肤致敏反应主要涉及三个连续的生物学过程。

首先，多数低（dī）分（fèn）子质量（通常小于500道尔（ěr）顿）的化学物质本身不能被免疫系统直接识别，因此它们需（xū）首（shǒu）先与皮肤中的蛋白质发生共价结合，形成所谓的（de）半抗原（yuán）复合物。这种修饰后的蛋（dàn）白质结构被免疫系统识别为“外来”，成为真正具有免疫原性的抗原，进（jìn）而触（chù）发迟发型（IV型）变态反（fǎn）应（yīng），即皮肤致（zhì）敏反应的起点；

第二步（bù）是（shì）角质形成（chéng）细胞的应激激活。在接触化学物（wù）质后（hòu），表皮中的角质形成细胞会被刺激而激活，释放一系列促（cù）炎因子（zǐ），如各种白细胞（bāo）介素和胸腺基质淋巴细胞生成素等。这些细胞因子的释放不仅增强局部炎症反应，还具有重要的免（miǎn）疫信号功能（néng），可吸引并激活（huó）树突状细胞（bāo）及朗（lǎng）格汉斯细胞向接触部位（wèi）迁移；

第三步是树突状（zhuàng）细胞的激活与抗原提呈。这些抗原递（dì）呈细（xì）胞在（zài）接（jiē）触刺激部位摄取（qǔ）半抗原复合物后，成熟并迁移至区（qū）域性淋巴结，在（zài）那里与（yǔ）T细胞相互作用，完成抗原提呈，最终形（xíng）成免疫记忆。该免疫记忆（yì）使（shǐ）得个（gè）体在后续暴露相同化学物质（zhì）时（shí）迅速（sù）出现过敏反应，表现为典型（xíng）的过（guò）敏性接触性皮炎。

从皮肤首次接触某种化学物质，到反复暴露后诱发过敏性接触性皮炎的全过程，在现代毒理（lǐ）学中被统称为“有害结（jié）局通路”。该通路由（yóu）多个生物学过程（chéng）构成，其中的关键环节被称（chēng）为“关键（jiàn）事件”。由（yóu）上文可知（zhī），皮肤致（zhì）敏的有害结局通路包含三个关键事（shì）件，即（1）半抗原形成；（2）角质形成细胞的激活和（3）树突状细胞激活。在所有已知（zhī）的“有害结局通路（lù）”中，皮肤（fū）致敏性“有（yǒu）害结局通路”是建立最早、机制最明确（què），且相对容易进（jìn）行体外模拟的免（miǎn）疫反应，因（yīn）此成为了替代方法开发的突破口。

在传统毒理学评估中，皮肤致敏性通常依赖动物整体反应模型进行判断，代表性方法包括：（1）豚鼠皮肤致敏试验，用于综合评估致敏起始阶段与激发阶段的反应；（2）局部淋巴（bā）结试验，聚焦于皮肤致（zhì）敏阶段。以局（jú）部淋巴结试（shì）验为例，一次（cì）标准实验需（xū）消（xiāo）耗至少20只小鼠。据（jù）统计，截至2018年，仅在欧盟REACH制度实施框架下（xià）就已有（yǒu）超过33,000只小鼠被用（yòng）于皮肤致敏性测试。

那么TG 497中所列（liè）的动物替代技术是如何实现的呢？TG 497 所采用的“三选二策略（luè）”是基于皮肤致敏（mǐn）性（xìng）有害结局通路中的前三个关键事件所构建的一种综（zōng）合性评估方法，旨在判定受试化（huà）学物是否具有皮肤致敏潜（qián）力。

首先，直接肽反应实验（DPRA，OECD TG 442C）用于评估第一关（guān）键事件，即被测物是否具有与蛋（dàn）白质共价结合形成半抗原的能力。该方法采用合成的含半胱氨酸或赖氨酸（suān）残基的肽段作为模型受体，与被测物（wù）共（gòng）同孵育后，通过测量肽的（de）消耗（hào）率评估其反应性。反应结束后，利用（yòng）高效液相色谱对肽段残留量进行定（dìng）量分析。若肽的消耗（hào）显著，说明化学物能与肽（tài）发生共价反应，具备潜（qián）在致敏性，从而完成对半抗原形成关键事件的评价。

其次，角（jiǎo）质形成细（xì）胞激活试验（yàn）（KeratinoSens™, OECD TG 442D）用（yòng）于评估第二关键事件——角质形成细胞的氧化应激与促炎反应激活，该事件（jiàn）在有害结局通路中处于信号放（fàng）大的早期阶段。KeratinoSens™方（fāng）法基于转基因人永生化角质形成细胞系（xì）HaCaT，该细胞稳定表达（dá）一个由抗氧化反应元件驱动的荧光素酶报告基因。当潜在致敏（mǐn）物（wù）质刺激角质形成细胞时，会引发细胞内（nèi）应激响（xiǎng）应，从而启动荧光素酶表达。通过测定荧光素酶活性，即可定量评估（gū）化学物对该通路的激活能力，进而判断其是否诱导角质形成细胞释放促炎因子。

最（zuì）后，人源树突状细胞活化实验（yàn）（h-CLAT，OECD TG 442E）模拟有害结局通路中的第三关键事件——树突状细胞的激活。在（zài）致敏过程中，被测物通过（guò）局部炎症信号（hào）激活树突状细胞（bāo），后（hòu）者在抗原识别、处理（lǐ）及向T细胞提呈抗原（yuán）的过（guò）程中起到桥梁作用。h-CLAT方法使用人急性（xìng）单核细胞白血病细胞系THP-1作为树突状细胞的替代模型。当（dāng）致敏化学物作用（yòng）于THP-1细胞后，若具免疫激活能力，将诱导其表面共刺激分子（如CD86和CD54）表达上调。通过（guò）流式细胞分（fèn）析检测这些表面标志物的相对（duì）荧光强（qiáng）度变（biàn）化，即可判断化（huà）学物是否具备激活免疫系统的潜能。

TG 497通过整合上述三种机制互补的体外方法，从（cóng）生物学不同层面（miàn）综合评估皮肤致敏性。只要任（rèn）意两项测试结果一（yī）致，即可（kě）做出科学、可靠的致敏性判断，从而实现在此毒理终点上对动物实（shí）验的完全替代。这三项方法各自针对皮肤致敏有害结局通路中的不同关键节（jiē）点（diǎn），组合（hé）使用时增（zēng）强了判断的稳健性和预测一致性。

TG 497被（bèi）正式写入OECD指南前，其开（kāi）发团（tuán）队以及欧盟替代方法验证中心、美国替代方法验证协调委员会和日本替代方（fāng）法验证中心都对（duì）其评估能力进行了验证，并与传统动物实验（yàn）方法如局部淋巴结试验做了对（duì）比，结果显示（shì）TG 497在多个核心指标上全面优于局部淋巴结试验。具体表现为（wéi）：在敏感性上，TG 497达（dá）到了87%，相比（bǐ）之下局部淋巴结试验（yàn）为72%，证明前（qián）者（zhě）在识别真正致敏物方面表现更优；在特异（yì）性方（fāng）面，TG 497为88%，也明显高于局部（bù）淋巴结试验（yàn）的75%，证明（míng）其在排（pái）除非致敏物时误判更少；在准确率（lǜ）上，TG 497为（wéi）87.5%，也高于局部淋巴（bā）结试验的73%，证明其（qí）在整体（tǐ）预（yù）测（cè）效能上表现（xiàn）更加平衡；更为关键（jiàn）的是，与人体不良反（fǎn）应数（shù）据的一致性上TG 497达到了“非常高”，而局（jú）部淋巴结试验仅为“中等偏高”，这表明TG 497在临床相（xiàng）关性上更具优势。

综上所述，TG 497不仅在科学性能（néng）上更为出色，而且由于其不（bú）依（yī）赖动物实验、与（yǔ）人体数据一致性更（gèng）高，因此得以成为目前首个（gè）被国际监管机构OECD采纳的完全替代皮（pí）肤致敏性动物试验的标准（zhǔn）体外测试方案。这一指（zhǐ）南（nán）的颁布也标志着毒理学替代方法从“辅助”迈入“决策级”应用的关键进展。

尽管（guǎn）TG 497的成功被视为替代毒理学领域的重要里程碑，但其背后反（fǎn）映出的研发过程也暴露了动物替代方法开发的诸多难点（diǎn）与局限。之所以能取得突破，首先因（yīn）为皮肤致敏反应是目前有害结局通路建立最完善的毒理路径之一，机制简单、事件明确、模拟容易（yì）。相比之下（xià），神经毒性、免疫毒性、内分泌干扰（rǎo）等终点路径复杂，机制不明确，至今尚无（wú）可实现完全替代的体外组合方法。其次（cì），TG 497研发成功的核心优势还在于拥有有大量来（lái）自因斑贴测试、临床案（àn）例和职业暴露的人体皮（pí）肤致敏不良反应数据可用于方法验证。而多（duō）数其它毒理领域仍严重（chóng）依赖于（yú）动物（wù）实验数据，缺乏可比对的人体资料，从而限（xiàn）制了相应替代方案的实际验证路径。即便如此，TG 497成（chéng）功进入OECD指南也历经了漫长的验证、标准（zhǔn）化与互认过程。三项子方（fāng）法最早提出可（kě）追溯至2006年前后，但直至2015年才以单独测试方（fāng）法形式被 OECD 采纳，2021年方整合为 TG497——整个流程耗时逾10年。

此外TG 497在皮肤致敏评估中仍存在化学品适用范围（wéi）的盲区：它仅适（shì）用于小（xiǎo）分子化学品，对金属离子、复杂混合物、亲水性或高反应性物质尚不适用；同时（shí），也不适用于易干扰测试（shì）系统稳定性的强刺激（jī）性或腐蚀性化合物。

可以说，TG497 的诞生既是一道（dào）分（fèn）水岭，也是一面镜子：一方面，它首次证明“综合测试方案”完全可以获得监管层面的认可，为 OECD 体系内其他毒理终点开发类似方法树立了（le）范式；另一方面，它警示我们，唯有深入掌握生物机制、系统整合多（duō）源数据并实现方（fāng）法标准化与多中（zhōng）心验证，替代策略方能真正落地。更进一步，TG497 的成功表明，替代路径（jìng）更适用于机制清（qīng）晰、易于体外模拟且人体数据相对充足的毒理终点。总之，替（tì）代并非简化，不（bú）是单凭热情就可以“一蹴而就”的（de），而是在更高科学规范要求下，通过持续演化与完善才（cái）能够得以实现；同时，其研发仍离（lí）不（bú）开动物实验与人体反应数据的对照与支撑。因此，尽管TG497 为全面替代动物实验开了一（yī）个好头，但在所（suǒ）有领域（yù）都（dōu）实现这一目标仍有漫长的（de）科学（xué）探索与制度建设之路要走。