基於FELASA實驗小鼠（shǔ）遺傳質量控製和遺（yí）傳檢測工作組的報告（gào），本公眾號（hào）前期文章《實驗大小鼠的遺傳質量控製和遺傳監（jiān）測: 標準化實驗大小鼠分類》一文介（jiè）紹了常見標準化齧齒類動物和幾種獲得遺傳工程齧齒動物的基本方（fāng）法。本文將繼續依據該報告的（de）內容，重點介紹如何進行小鼠遺傳質量控製和遺傳監測。

當你的（de）設施有新構建或者引入一種GA（Genetically altered）齧齒類動（dòng）物時，應完整記錄（lù）這些動物的詳細信息。同時，這些信息也必須伴隨（suí）著相（xiàng）應動物品係一起傳遞給所有可能會使用它的研究者。這些信息包括但（dàn）不限於：正確的品係名稱（chēng）、對（duì）於突變的完整（zhěng）描述（shù）、動物的遺傳背景、基因鑒定（dìng）方案和相關表型描述等。設施管理者可以設計（jì）一些固定格式的表格用於記錄這些信息。

關於命名法重要性的概述（shù），可（kě）以參考“FELASA轉基（jī）因齧（niè）齒動物生產和命名指南（nán）”。沒（méi）有一個公（gōng）認的命名法，就不可能準確地交（jiāo）流科學（xué）成果。同時模（mó）糊或（huò）不完整的（de）命名會引（yǐn）發錯誤（wù），會使實驗結果的可重複性降低。因此，應根據國際命名規則命名不同品係。特別（bié）是（shì）當同一品係被保存在世界各地不同的設施或它們被加入數據庫中（zhōng）時（shí），這一點顯得尤為重要。指導命名的規則由國際小鼠和大鼠標（biāo）準化遺（yí）傳命名委員會製定（dìng），並不斷更新。這些規則最近一次修訂是在2016年1月，在MGI網頁的“小鼠和大鼠品係命名指南”中有詳細描述（shù）。

遺傳變異的來源

齧齒類動物設施麵臨的（de）一個重要挑戰是保持近交（jiāo）係的遺傳背（bèi）景純正，並將GA係動物維持在明確的遺傳背景之下。近交係的遺傳變異可能由以下因素產生：（a）意外的雜交造（zào）成的（de）汙染；（b）由於殘留的雜合性（xìng）或新的自發突變的固定造成的遺傳漂變。遺（yí）傳變異的引入通（tōng）常有以下幾種途徑：

（1）遺傳（chuán）汙染

來自一個近交係（xì）的個體與另一（yī）個來源的動（dòng）物意外交配（pèi）導致的基因汙染是近交係中遺傳譜係改變的最重要來（lái）源。這種類（lèi）型的（de）基因汙染會導致等位基因發生突（tū）然的大規模改變，尤其在具有相同（tóng）被毛顏色（sè）的品係中更容易發生，例如帶有白化等位基因(Tyrc /Tyrc )、agouti(A/A)或非agouti(a/a)的品係之間。因此在飼（sì）養具有相同被毛顏色的不同品係動物時需要格外小心（xīn），盡可能防止其近距離接觸。有關小鼠毛色遺傳，可參閱本號前文《小鼠的毛色是如何形成的？》

（2）自發突變

自發突變是在個體（tǐ）中由於自（zì）然存（cún）在的誘變劑或DNA複製、轉錄、修複時偶然出現（xiàn）的堿基配對錯誤而產生的突變，是一種不受控製的遺傳變異來源，通常無法通過簡單的表型觀察或者常規的遺傳監測發現（xiàn）。

（3）遺傳漂變

遺傳漂變是指某個小群體中（zhōng），由（yóu）於新突變的出（chū）現以及殘留雜合性的等位基（jī）因逐步（bù）固化在純合狀態，並（bìng）取代了原（yuán）來的等位（wèi）基因的（de）過程。

當同一品係在不同地方獨立繁殖（zhí）時，遺傳漂變對（duì）品係的分化和亞品係的產生（shēng）有不可忽視的作用（yòng）。小鼠亞品係的例子很多，例如，已發現有10個有記錄（lù）的BABL/c亞係和15個C57BL/6亞係，包括來自傑克遜（xùn）實驗（yàn）室的C57BL/6J和來自美國國立衛生研究院（NIH）的C57BL/6N亞係。同樣，許多大鼠近交係也至少有兩個亞（yà）係，例如SHR至少有四個亞係，包括SHR/Ola和SHR/NCrl；WKY和F344至少（shǎo）各有三個（gè）亞係。

（4）乘客突變

乘客突變（biàn）是（shì）指隱藏在（zài）亞係或者是GA係動物的基因組中的突變，這些突（tū）變在某些特定情況下能（néng）夠影響到動物（wù）實驗結果。例如在最常見的C57BL/6中的兩個亞係C57BL/6J和C57BL/6N，由於一些自發的（de）突（tū）變，如C57BL/6N中出現了可導致（zhì）視（shì）網膜退變的（de）Crb1rd8突變，而C57BL/6J中則出現（xiàn）了Nnt基因的缺失。正因這類（lèi）乘客突變的存（cún）在，在進行表型分析時，要（yào）特別注意觀察到的表型是由於目標基因的修飾還（hái）是遺傳背景中存（cún）在的突變造成的，並藉此選擇合適（shì）的對照組動物（wù）。

遺傳質量控製方案

目前實驗齧齒類動物的遺傳質量控製金標準是依靠遺傳標記多態性來區分不同的遺傳背（bèi）景。

遺傳標記是染色體上已（yǐ）知位置的特定DNA序列，是遺傳質量控製（zhì）的基本工具。遺（yí）傳質量控（kòng）製對確定動（dòng）物的遺傳組成，確定品係的一致性和真實性是必要的。值得注意的（de）是，一般不（bú）會對封閉群動物（wù）進行遺傳標（biāo）記一致性的檢測，相反，應該對封閉（bì）群動物的遺傳異質性水平（píng）進行確認，以檢測（cè）遺傳汙染（rǎn），監測育種方案的科學性。

標記係統（tǒng）

大鼠和小鼠中已經發現多種（zhǒng）多（duō）態（tài）性，然而，在目前的質量（liàng）保證方案中（zhōng），隻有微衛星DNA和SNPs被用作遺傳標記（jì）物。微衛星（xīng）標記，又被稱為短串聯重複序列(short tandem repeats,STRs)或簡（jiǎn）單重（chóng）複序列（simple sequence repeats，SSR），是均勻分布於真核生物基因組中的簡單重（chóng）複序（xù）列，其典型結構是由2～6個核苷酸的序列（liè）串聯重複幾次到幾十次構成，這種重複造就了染色體之間的等位基因多樣性。微衛星標記通常先通過PCR方式擴增包（bāo）含微衛星序列的區域，再對擴增（zēng）產物通過電泳（yǒng）分析和片（piàn）段大小進行等位基因差異分析。

SNP分型（xíng）是（shì）微衛星標（biāo）記的（de）一種替代方法，現在（zài）應用範圍更（gèng）廣。SNP多態性是指（zhǐ）在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，編碼區和非編碼區都有SNP的存在。

傑克遜實驗室的Petkov和他的同事從48個小鼠品係中的235個SNPs的等位基因中選擇了28個SNP，這些位（wèi）點已足以區分（fèn）傑克遜實驗室所保存的約300個近交（jiāo）係、野（yě）生型、同類（lèi）係、染色體置換係和重組近交係中（zhōng）的大多數（shù）動（dòng）物。一些研究者（zhě）也報道了（le）大鼠可用的SNPs。例如，Zimdahl和（hé）他的（de）同事描述（shù）了來（lái）自轉錄區的超過12,000個SNPs。

近交（jiāo）係（xì）和遠交係的遺傳監測

目前（qián）（在歐美國家）使用的主流的遺傳監測技術是基於微衛星或SNPs 的檢測。然（rán）而，我們建議，除了分子（zǐ）技術，同時也應該監測動物的表型參數，如毛色、行（háng）為和繁殖能（néng）力等。商業育種者對控製遺傳汙染的發生應更為重視，並定期（qī）監測其品係的遺傳質量。傑克遜實驗室采用了一種獨特的、已獲專利的遺傳穩定（dìng）計劃，即通過每五代就重新（xīn）從純種的、冷凍的胚胎中重建（jiàn）他（tā）們（men）的基礎種群來（lái）有效地限製遺傳漂變的積累。例如，從2005年開始，他們出售的C57BL/6J小鼠都是兩隻選定的小鼠的（de）後代，而他們（men）冷凍的數百個胚胎足以持續使用25-30年。特別需要注意的是，當從冷凍庫存中複（fù）蘇胚胎時，也應進行遺傳檢（jiǎn）測，以確保冷凍前及冷凍過程中（zhōng）沒有發生遺傳汙染或其他錯誤。

對於遠（yuǎn）交係，遺傳監測有助於保（bǎo）持群體的遺（yí）傳多樣性和（hé）等位基因庫。這個過程更為複雜，需要分析大量的動物，並將這些數據與曆史數（shù）據進行比較，記錄（lù）存在的等位基因、它們的頻率和該特定群體的雜合（hé）度水平。在某些情況下遺傳（chuán）多樣性缺失的結果會導致一個群體的異質性降到較低水平（píng）。低異質性可能是源於繁殖種群的（de）選擇不當，繁（fán）育體係執（zhí）行中的偏離（lí），或是起始的繁殖群體過小（xiǎo）。相反，過高的異質性可能是由近（jìn）期出現的（de）遠交造成的。大體上，需通過測量表型性狀和計算相應的平均值和標準差來描述遠交係的基本特（tè）征。對遠交係遺傳控製的原則是避免近（jìn）親繁殖並在（zài）各代中保持其遺傳多樣性。

自繁近交係小鼠和大鼠的遺傳監測（cè）

建議從可靠的供應商購處買動物，並在10代後用同一供應商的動物替換繁殖種群，不建（jiàn）議長（zhǎng）期維持經典近交品係的獨立種群。使用來自同一供應商的動物可以有效的防止（zhǐ）產生突變的亞品係（xì）。同時，自繁動物也應（yīng）該用微衛星標記或SNPs檢測進行（háng）遺傳質量監測，以確保其遺傳質量的可靠性（xìng）。

微衛（wèi）星檢測可以（yǐ）用於驗證近交係小鼠品係背景的純度，是否有遺傳（chuán）汙染的痕跡。這對於在同一（yī）飼養間內飼（sì）養具有相同（tóng）毛色的品係的動物設施，尤（yóu）其是在（zài）不使用IVC籠（lóng）具的設施來說尤其重要。微衛星檢測的標記物數量尚未標準化，標記（jì）物的選擇應根（gēn）據（jù）設（shè）施維（wéi）持品係的種類和數量進行相應的調整。

由於近交係動物的基因序列（liè）高度一致，基因都是純合的，當對（duì）一個特定的微衛星位點進行基因（yīn）分型的時候，在電泳時隻會呈（chéng）現單一條帶，代表一個等位基因（yīn），而任何雜合性（xìng）的存在，例如有兩個條帶或者與對照組條帶大（dà）小不一致（zhì）時，就應該被視為有潛在的汙染（圖1）。

圖1. 通過SSLP PCR檢測基因汙染的例子

圖片是PCR擴增後得到的特征（zhēng）條帶（dài），這些條帶來自四隻據稱屬於BALB/c品係的（de）小（xiǎo）鼠的基因組DNA(每組的（de）前四個泳道)，加上（shàng）BALB/c的標準DNA對照(最後一個泳道)。本圖片隻顯示了（le）位於1至5號染色（sè）體（tǐ）上的五個SSLP位點。可見存在（zài）雜合性(兩（liǎng）條帶)和不符合BALB/c標準的條帶大小的條帶存在。

對於種群數量較小，且采用隔離飼養，也沒有（yǒu）高（gāo）頻次動物引進的設施，每兩（liǎng）年一次檢測就可以有效的監測動物遺傳質量。

使用SNP組監測動物遺傳質量時，利用均勻分布在染色體（tǐ）上的四十（shí）多個SNPs就可以有效檢出近期發生的遺傳汙染（rǎn），檢測位點數量可根（gēn）據每個機構的實際情況和設施（shī）麵對（duì）的風險程度而定。SNP基因分型目前可以（yǐ）在不同的平台上進行，其成本和自動化能力（lì）各不（bú）相同。Kompetitive Allele Specific PCR(KASP)和Taqman實時熒光（guāng）定量PCR是常用的檢測方式，相比較而言，前者的自（zì）動化程度更高，成本更低（dī），但對檢測樣本量的下限有一定要（yào）求。

遠交係種群的遺傳質量（liàng）監測

遠交係的遺傳質量（liàng）監測比近交係（xì）要複雜的多，因為這些動物的基因並不（bú）一樣，它們本質上是一群密（mì）切相關的動（dòng）物，有共同的（de）祖先和群體特征，但表現出一定程度的遺傳多樣性，所以僅僅用（yòng）少量（liàng）的遺傳標記就很難建立一個標準的遺（yí）傳監測方案。然而，通過監測足夠數量（liàng）的SNPs或者SSLPs位點，就可以說（shuō）明群體內（nèi）的等位基因頻率和種群的遺傳特（tè）征。

遠交係遺傳質量（liàng）控製麵臨的主要問題之一是，許多管理者用非常小規模的繁殖種（zhǒng）群，導致種群中有代表性的等位基因（yīn）數量減少，增加了近親繁殖係數，這種種群既不是真正意義（yì）上的遠交係，也不是近交係。因此，如（rú）果無法維持適當基（jī）數（shù）的繁殖（zhí）種群的時候，就建議從那些有大規模繁殖種群的供應商處（chù）購買遠交係動物，或者遵循推薦的繁殖方案，以減少近親繁（fán）殖。

參考文獻：

[1] Benavides F , T Rülicke,  Prins J B , et al. Genetic quality assurance and genetic monitoring of laboratory mice and rats: FELASA Working Group Report:[J]. Laboratory Animals, 2020, 54(2):135-148.